細胞克隆形成試驗
細胞克隆形成試驗是測定單個(gè)細胞增殖能力的有效方法之一。其基本原理是單個(gè)細胞在體外持續增殖6代以上時(shí)細胞數量已達60個(gè)左右,此細胞群體成為克隆或集落,大小在0.3~1.0mm之間。通過(guò)計數克隆形成率,可對單個(gè)細胞的增殖潛力做定量分析,了解細胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應性??寺⌒纬陕矢哒咂洫毩⑸婺芰?,例如永生性細胞或癌細胞克隆形成率高,正常細胞則很低。常用的方法有平板克隆形成試驗和軟瓊脂克隆形成試驗。
一、材料
1.待測的培養細胞。
2.細胞培養液.0.25%,PBS溶液,Giemsa染色液。
3.培養皿.吸管,培養板。
4.CO2培養箱,倒置顯微鏡。
二、方法
1.制備細胞懸液低密度細胞懸液一般根據需要配成]0~100個(gè)/ml。取生長(cháng)良好的對數生單層培養細胞,吸出培養瓶?jì)鹊呐囵B液,用0.25%消化并吹打成單個(gè)細胞,把細胞懸浮在含10%牛血清RPMI 1640培養液中備用。
2.接種和培養用吸管輕輕吹打細胞懸液,使之混懸均勻后,將細胞懸液作梯度倍數稀釋?zhuān)赃m當的細胞密度(根據增殖能力)接種于培養皿中。一般分每皿50、100、200個(gè)細胞的梯度密度分別接種于含10ml 37℃預溫培養液的培養皿中,并輕輕轉動(dòng),使細胞分散均勻。置37℃ 5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下,靜置培養2~3周。
3.觀(guān)察當培養皿中出現肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí),終止培養。棄去上清液,用PBS小心洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml,固定15min。然后棄掉固定液,加適量Giemsa應用染色液染10~30min,然后用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。
三、結果分析
1.計算各皿克隆數將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片,用肉眼直接計數克隆,或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個(gè)細胞的克隆數。
2.計算克隆形成率計算公式為:
克隆形成率=克隆數/接種細胞數×100%
四、注意事項
1.克隆形成率與接種密度有一定關(guān)系,為減少實(shí)驗誤差,細胞懸液中細胞應分散充分,單個(gè)細胞比率至少在90%以上。此外,接種密度不能過(guò)大。
2.培養期問(wèn)應根據培養液pH變化適當更換培養液。
3.平板克隆形成試驗方法簡(jiǎn)單,適用于貼壁生長(cháng)的細胞。
4.由于細胞生物學(xué)性狀不同,細胞克隆形成率差別也很大,一般初代培養細胞克隆形成率弱,傳代細胞系強;二倍體細胞克隆形成率弱,轉化細胞系強;正常細胞克隆形成率弱.腫瘤細胞強。
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