制備感受態(tài)細胞：

1、從37℃培養16-20h的平板中挑取一個(gè)單菌落（直徑2-3mm），轉到一個(gè)含有100mlLB或SOB培養基的1L燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養3h。一般經(jīng)驗，1OD600約含有大腸桿菌DH1×109個(gè)/ml。

    為達到轉化，活細胞數務(wù)必少于108 細胞/ml，對于大多數大腸桿菌來(lái)說(shuō)，這相當于OD600值為0.4左右。為保證細菌培養物的生長(cháng)密度不致過(guò)高，可每隔15-20min測定OD600 來(lái)監測，用監測的時(shí)間及OD600 列一個(gè)圖表，以便預測培養物OD600值達到0.4的時(shí)間，當OD600值達到0.35時(shí)，收獲細菌培養物。

    在菌株和菌株之間，OD600值與每毫升活細胞數見(jiàn)的關(guān)系變化很大，因此有必要通過(guò)測定特異大腸桿菌的生長(cháng)培養物在生長(cháng)周期的不同時(shí)相的OD600值，并將各稀釋濃度的培養物鋪于物抗生素的LB瓊脂板以計算每一時(shí)相的活細胞數，從而使分光光度計讀數得到標準化。

2、將細菌轉移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培養物冷卻至.0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3 轉頭以4100r/min離心10min，以回收細胞。

4、倒出培養液，將管倒置1min以使zui后的痕量培養液流盡。

5、每50ml初始培養液用30ml預冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀。

6、于4℃用Sorvall GS3 轉頭以4100r/min離心10min，以回收細胞。

7、倒出培養液，將管導致1min以使zui后的痕量培養液流盡。

8、每50mo初始培養物用2ml用并預冷的0.1mol/L CaCl2（或TFB）重懸每份細胞沉淀。

9、此時(shí)，可以按步驟10-16用新鮮制備的感受態(tài)細胞直接做轉化實(shí)驗，也可以將細胞凍存于-70℃。

轉化：

包括陽(yáng)性和陰性對照

10、用冷卻的無(wú)菌吸頭從每份用CaCl2溶液制備的感受態(tài)懸液中西區200ul轉移到無(wú)菌離心管（17*100mm）中，每管加入DNA（用不超過(guò)10ul的體積，其中的DNA小于50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。

11、將管放入預加熱至42℃的循環(huán)水浴中，恰恰放置90s，不要搖動(dòng)管。

熱激是一個(gè)關(guān)鍵步驟，準確地達到熱敷溫度非常重要。

12、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2min。

13、每管加800ulSOC培養基，用水浴將培養基加溫至37℃，然后將管轉移到搖床上，溫育45min，使細菌復蘇并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標記基因。

    復蘇期中應于37℃溫和地搖動(dòng)細胞（用低于50r/min轉速的搖床）。

14、將適當體積（每個(gè)90mm平板達200ul）已轉化的感受態(tài)細胞轉移到含20mmol/L MgSO4和相應抗生素的SOB瓊脂培養基上。

    如果用四環(huán)素作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個(gè)單獨的平米上（或軟瓊脂中），可以現在微量離心機哈桑室溫離心20s以收集轉化菌，加100ulSOC重懸沉淀，輕輕混勻。

    重要：玻璃鋪菌器需先在乙醇在浸泡，然后在酒精燈上灼燒，待它涼至室溫后，才可將轉化菌輕輕地鋪在瓊脂板上。

    如檢查氨芐的抗性，用轉化菌鋪平板時(shí)密度應較低（每個(gè)90mm平板不超過(guò)104菌落），于37℃培養的時(shí)間按不超過(guò)20h。氨芐抗性的轉化體可將β-內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周?chē)鷧^域的。這樣，鋪平板時(shí)密度過(guò)高或培養時(shí)間按過(guò)長(cháng)都會(huì )導致出血對氨芐敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨芐而用羧芐，以及將抗生素濃度從60ug/ml提高到100mg/ml,可使情況有所改善，但不能產(chǎn)地*之?？拱逼S的增加與平皿上所加的細菌數的增加并無(wú)線(xiàn)形比例關(guān)系，這可能是因為被抗生素殺死的細胞釋放生長(cháng)抑制物質(zhì)的緣故。

15、將平板置于室溫直至液體被吸收。

16、倒置平皿，于37℃培養，12-16h后可出現菌落。