1. 17羥孕酮Elisa試劑盒標本的采取和保存
大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時(shí)會(huì )釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時(shí)檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。一般說(shuō)來(lái)，在5 天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(cháng)導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過(guò)一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫入x心或過(guò)濾，澄清后再檢測。反復凍融會(huì )使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應注意無(wú)菌操作，也可加入適當防腐劑。
抗凝不*的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽(yáng)性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。
2.加樣
加樣時(shí)應將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。
3.保溫
17羥孕酮Elisa試劑盒在建立ELISA 方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)
1-2 小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時(shí)間應按規定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(huì )造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應，邊上的值會(huì )偏高，建議為了客觀(guān)的判斷結果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
 4.洗滌
 洗滌在ELISA 過(guò)程中雖不是一個(gè)反應步驟，但卻決定著(zhù)實(shí)驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來(lái)達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA 操作中，洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗板時(shí)注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋?zhuān)瑧匆笙♂專(zhuān)玫乃妼试?.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時(shí)間為40 秒左右，孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡。
5. 顯色和比色
TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40 分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2 小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間（12-24 小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(cháng)（450nm）測讀吸光值。酶標比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標儀，通常指于測讀ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、度和可測范圍、線(xiàn)性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數一般可到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽(yáng)光或強光照射下，操作時(shí)室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30 分鐘，測讀結果更穩定。
測讀A 值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長(cháng)。有的酶標儀可用雙波長(cháng)式測讀，即每孔先后測讀兩次，次在zui適波長(cháng)（W1），第二次在不敏感波長(cháng)（W2），兩次測定間不 移動(dòng)ELISA 板的位置，zui終測得的A 值為兩者之差（W1-W2）。17羥孕酮Elisa試劑盒雙波長(cháng)式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。