植物茄呢醇磷酸酶2反應的溫度和時(shí)間
實(shí)驗中顯色是植物茄呢醇磷酸酶2中的zui后一步溫育反應,此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內,陰性孔可保持無(wú)色,而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(cháng)而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時(shí)間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)間一般不需要嚴格控制,有時(shí)可根據陽(yáng)性對照孔和陰性對照孔的顯況適當縮短或延長(cháng)反應時(shí)間,及時(shí)判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,再延長(cháng)反應時(shí)間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì )自行變色,顯色反應應避光進(jìn)行,顯色反應結束時(shí)加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉向棕黃色。
elisa試劑盒TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應觀(guān)察結果。但為保證實(shí)驗結果的穩定性,宜在規定的適當時(shí)間閱讀結果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,至2小時(shí)后即可*消退至無(wú)色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間(12-24小時(shí))不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色,此時(shí)可用特定的波長(cháng)(450nm)測讀吸光值。
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