豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌PCR試劑盒產(chǎn)生各種條帶的常見(jiàn)原因

1.產(chǎn)生非特異性條帶

1)用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

2)在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產(chǎn)生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產(chǎn)生。

3)由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產(chǎn)生不同的RT-PCR結果。

2. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶

1)在PCR反應體系中di一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高

2)減少引物的用量

3)優(yōu)化PCR反應條件/減少PCR的循環(huán)次數

4)在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì )產(chǎn)生非特異性擴增，一般會(huì )顯示為彌散背景。

3. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

1)大多數情況下是由于退火溫度過(guò)低而導致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

2)對于長(cháng)片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）