預期應用ELISA法定量測定人血清、血漿、腦脊液或其它相關(guān)液體中Ach含量。

實(shí)驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中Ach水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Ach、化的抗人Ach抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Ach呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。ELISA試劑盒 
試劑盒組成及試劑配制 
1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為1000 nmol/L，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成1000 nmol/L，500 nmol/L ，250 nmol/L，125 nmol/L，62.5 nmol/L，31.2 nmol/L，15.6 nmol/L，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 nmol/L，臨用前15分鐘內配制。

如配制500 nmol/L標準品：取0.5ml 1000 nmol/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋?zhuān)♂屒案鶕A先計算好的每次實(shí)驗所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

標本的采集及保存

1．腦脊液：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃，且應避免反復凍融。

2．血清：標本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會(huì )影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標板加上蓋，37℃反應120分鐘。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃，60分鐘，洗板5次，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時(shí)肉眼可見(jiàn)標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時(shí)蘭色立轉黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長(cháng)依序測量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實(shí)驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時(shí)先用此孔調OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時(shí)將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實(shí)驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，根據需要，重復此過(guò)程數次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機，應在熟練使用后再用到正式實(shí)驗過(guò)程中。
特異性
    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人Ach，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應。

計算
  以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線(xiàn)，根據樣品的OD值由標準曲線(xiàn)查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項
1．  洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。

2．  一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內，如標本數量多，使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時(shí)做標準曲線(xiàn)，做復孔。

4．  如標本中待測物質(zhì)含量過(guò)高，請先稀釋后再測定，計算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數。

5．在配制標準品、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應的稀釋液配制，不能混淆。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：
15.6 nmol/L -1000 nmo/L

說(shuō)明 
1．試劑盒保存：-20℃（較長(cháng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。ELISA試劑盒 

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì )有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì )含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F象，不會(huì )對實(shí)驗結果造成任何影響。