elisa試劑HRP的底物與AP的底物對比

1.AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate,p-NPP）作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長(cháng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于Elisa作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 

2 HRP的底物 
HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應，代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反應式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O 
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在Elisa中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺（O-phenylenediamine,OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）和 ABTS[2,2’-azino-di-（3-ethylbenziazobine sulfonate-6）]。 
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有zui高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物zui常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時(shí)應予注意。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2 一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。

TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在Elisa中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，zui適吸收波長(cháng)為405nm。 
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。 
另一種HRP的底物為3-（4-羥基）苯丙酸[3-（4-hydroxy）phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于Elisa的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線(xiàn)性范圍。 
HRP對氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物（urea peroxide）。H2O2應用zui多，但尿素過(guò)氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩定。試劑盒供應尿素過(guò)氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩定1年。

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